SEARCH
技術服務021-34781616

熱門搜索關鍵詞:轉錄組基因組甲基化酵母文庫蛋白芯片

021-34781616

當前位置:首頁 » 新聞資訊 » 技術&解讀&應用 » 項目文章 | 酵母三雜交技術解析家蠶雙性基因doublesex可變剪切機制

基本信息

論文題目: 

Alternative splicing regulation of doublesex gene by RNA-binding proteins in the silkworm Bombyx mori

發表期刊:RNA Biology

發表時間:2019.3

影響因子:5.216

合作單位:武漢大學

本文涉及的高通量技術酵母文庫(歐易生物提供建庫服務)/酵母三雜交

研究背景

作為重要的模式生物和經濟昆蟲,家蠶的性別決定一直是研究人員關注的熱點。雙性基因doublesex (dsx) 在基因轉換器TRA1和TRA2的共同作用下產生可變剪切, 決定雌性特異基因產物DSXF或雄性特異基因產物DSXM的產生。因此,家蠶dsx基因是家蠶性別特異轉錄調節機制的雙開關基因。但在家蠶中尚未發現TRA的同源體,dsx基因的可變剪切調控過程依然是未知的。

研究內容

作者利用酵母三雜交技術(yeast three-hybrid),篩選調控家蠶dsx基因第3和第4外顯子剪切的RNA結合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)。結果表明,BxRBP1/Lark能夠結合第3外顯子,BxRBP2/TBPH和BxRBP3/Aret能夠結合第4外顯子。BxRBP3有四個轉錄本,其中三個轉錄本具有性別特異的表達模式。進一步研究發現,BxRBP1 和 BxRBP3直接互作,共同發揮剪切抑制子的功能。過量表達BxRBP1 和 BxRBP3,能夠抑制雌性特異細胞中dsx基因第3和第4外顯子的剪切,從而形成雄性特異基因產物。另外,作者證實了性別決定通路上游基因Masc調控BxRBP3的可變剪切。本文闡釋了家蠶雙性基因doublesex可變剪切調控機制,以及昆蟲性別決定機制的分歧進化。

研究結果

1. 作者構建了家蠶雄性胚胎,雌性胚胎以及睪丸組織三個酵母文庫,利用dsx基因的第3和第4外顯子構建誘餌載體(pIIIA/MS2-2),分別進行酵母三雜交篩庫。結果表明,BxRBP2在三個文庫中都能夠與dsx的第4外顯子互作,而BxRBP1和 BxRBP3與第3和第4外顯子的互作僅發生在睪丸文庫中。以上互作都通過了質粒回轉驗證。序列分析結果顯示,這三個基因在果蠅以及哺乳動物中都具有同源基因,并且編碼蛋白包含多個RNA識別序列(RNA recognition motifs,RRMs)。

 

2. 為了獲得上述三個基因的全長轉錄本及可變剪切序列,作者用雄性和雌性家蠶組織做了5'- 和3'-RACE。BxRBP1有三個轉錄本,其中兩個較長的轉錄本編碼相同的蛋白,并且具有兩個RRMs和一個鋅指結構域,較短的轉錄本不具有RNA結合功能。BxRBP2只有一個轉錄本,編碼兩個RRMs。BxRBP3有四個未報道的轉錄本,命名為BxRBP3-A, -B, -C 和 –D 。轉錄本A,B和C編碼三個RRMs,而最短的轉錄本D缺少第一個RRM。

接下來,作者驗證了這些轉錄本編碼的蛋白對dsx基因外顯子的結合能力。與前文酵母三雜交的結果一致,全長BxRBP1只能結合第3外顯子,全長BxRBP2只能結合第4外顯子。BxRBP3-A, -B和-C能夠結合第4外顯子,而BxRBP3-D不能結合第4外顯子,說明第一個RRM對BxRBP3的活性具有重要作用。進一步的β-半乳糖苷酶活性檢測結果表明,BxRBP3-A和-B具有相似的RNA結合能力,-C的結合能力下降40%左右,-D的結合能力完全喪失。

 

 

 

3. BxRBP1和BxRBP2在雄性及雌性組織中具有相似的表達水平,而BxRBP3-A, -B和-C具有性別偏好的表達模式。作者另外采用家蠶細胞系驗證了這個結果。

 

4. 作者在雄性和雌性家蠶細胞系中檢測三種蛋白對dsx基因可變剪切的調控。在雌性細胞系中,上游調控基因Masc能顯著抑制dsx基因第3和第4外顯子的剪切,而BxRBP3的四個異構體僅能微弱抑制上述外顯子的剪切,產生雄性特異的可變剪切產物。相比之下,過量表達BxRBP1或者BxRBP2對dsx基因的可變剪切沒有顯著改變。值得注意的是,在雄性細胞系中dsx基因的可變剪切不受到任何RBP的調控。

作者進一步檢測同時過量表達兩個RBPs對可變剪切的影響。結果表明,BxRBP1能夠顯著提高BxRBP3對dsx基因外顯子的剪切抑制,產生更多的雄性特異基因產物。其中BxRBP1與BxRBP3-B共同作用,能使65%的雌性特異基因產物轉換為雄性特異產物。而BxRBP2不具備性別轉換調控能力。

 

  

5. BxRBP1-3在昆蟲和哺乳動物中都是高度保守的,但是在BxRBP2氨基酸序列上缺少N端的核定位信號(NLS)。因此作者采用EGFP融合蛋白檢測BxRBP1-3在家蠶細胞系中的亞細胞定位。結果表明,BxRBP1,BxRBP3-B和BxRBP3-D主要定位在細胞核中,而BxRBP3-A和BxRBP3-C則主要定位在細胞質中。這個結果同樣證實了BxRBP1與BxRBP3具有調控dsx基因外顯子剪切的能力。

 

6. 那么BxRBP1與BxRBP3是否存在相互作用呢?酵母雙雜交表明,BxRBP1能夠與BxRBP3-B互作,與另外三個BxRBP3異構體互作很微弱。作者另外通過GST pull-down驗證了上述結果。有文獻報道,PSI和IMP能結合dsx基因的第4外顯子,因此作者檢測了二者與BxRBPs的互作關系。酵母雙雜交表明,PSI能夠與BxRBP3互作,而與BxRBP1和BxRBP2之間沒有直接互作。另外,IMP與三個BxRBPs都沒有互作。

 

 

7. Masc是一個具有鋅指結構域的轉錄因子,作者在過量表達Masc和對照細胞系中分析了BxRBPs的表達水平。Masc促進了BxRBP3-A和-B的表達,而BxRBP3-C和-D的表達量沒有明顯變化。另外,BxRBP1和BxRBP2的也不受到Masc的調控。

 

 

8. 作者構建了包含dsx基因所有外顯子以及截短內含子的可變剪接微型基因(mini-gene),檢測Masc和BxRBPs是否能夠直接調控dsx基因的可變剪切。在雌性家蠶細胞系中,dsx微型基因以雌性特異模式剪切。過量表達Masc能夠有效抑制第3和第4外顯子的剪切,產生雄性特異基因產物。過量表達BxRBP1或BxRBP3-B,能產生缺少第3或第4外顯子的雌性特異基因產物。在人源HEK293T細胞系中,dsx微型基因被剪切成為兩組相似的雌性特異基因產物,其中一組額外包含一段來自第4外顯子的59nt片段。過量表達Masc不能抑制dsx微型基因第4外顯子的剪切,表明Masc是家蠶特異的調控因子。然而,過量表達BxRBP3-B能夠有效抑制第4外顯子的剪切。

總 結

本文利用酵母三雜交技術,篩選到家蠶雙性基因dsx第3和第4外顯子的三個RNA結合蛋白,其中BxRBP1和BxRBP3直接參加靶基因的可變剪切,解析了家蠶性別決定調控機制。

參考文獻

Zeng-Zhang Zheng, Xia Sun, Bei Zhang, Jia Pu, Ze-Yu Jiang, Muwang Li, Yu-Jie Fan & Yong-Zhen Xu (2019): Alternative splicing regulation of doublesex gene by RNA-binding proteins in the silkworm Bombyxmori, RNA Biology, DOI: 10.1080/15476286.2019.1590177

- END -

本文系歐易生物原創

轉載請注明本文轉自歐易生物


歐易生物

技術熱線:021-34781616 咨詢熱線:4006-4008-26

上海市閔行區新駿環路138號5幢3層
[email protected]
歐易生物
歐易生物微信公眾號
滬ICP備-050455 網站地圖  Copyright ? 2016 上海歐易生物醫學科技有限公司 保留所有權利      
ticaiapp