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項目文章 | 歐易生物免疫組庫測序技術助力肝再生機制研究

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瀏覽:- 發布日期:2018-09-26 09:51:12【

前言

今天,小編為大家分享的文章,是由歐易生物與免疫組庫研究專家團隊經過密切合作,通過高通量測序技術及利用生物信息學方法對高通量測序后的大數據進行分析,成功總結出的疾病模型下免疫組學核心算法。

相關研究成果已發表在Hepatology(IF=14.079)等高影響因子雜志。

基本信息

英文標題:Intrahepatic T cell receptor β immune repertoire is essential for liver regeneration

中文標題:肝內T細胞受體β免疫組庫對肝再生是必需的

發表期刊:Hepatology

發表時間:2018.04

影響因子:14.079

研究目的:TCRβ免疫在肝再生中的作用

研究樣本:C57BL/6(野生型小鼠4例),Tcrb-/-(TCRβ 鏈缺失的部分肝切除小鼠4例), TcrbAD-Cre(通過Cre重組得到的TCRβ鏈缺失的部分肝切除小鼠4例)

研究技術:TCR β測序,免疫組化,免疫熒光,WB,RT-qPCR,流式細胞,細胞因子檢測

研究結果

1. TCRβ缺失導致肝再生受損

免疫組化分析證明TCRβ鏈在Tcrb-/-和TcrbAD-Cre小鼠中缺失。這兩種TCRβ鏈缺失小鼠在接受部分肝切除術后,其肝臟在外觀、大小、重量上和野生小鼠的沒有明顯差異,但是血清轉氨酶水平(肝損傷指數)、空泡樣變性肝細胞、肝-體比重等明顯降低(Fig. 1A-D)。此外,相比于野生小鼠,Tcrb-/-和TcrbAD-Cre小鼠的肝細胞增值急劇減少(Fig. 1G, H),肝細胞凋亡提高(Fig. 1E, F)。這些數據表明TCRβ對肝細胞增殖和肝再生是必不可少的。

Fig 1. TCRβ對肝再生是必須的

 

2. 肝切除后TCRβ缺失引發異常的炎癥環境

TCRβ缺失急劇降低炎癥因子的表達,包括炎癥信號通路p-STAT3(Fig. 2A, B)、以及細胞因子IL-6、IL-4、TNF-α(Fig. 2C)在Tcrb-/-和TcrbAD-Cre小鼠中的表達量明顯低于野生小鼠,IL-17在Tcrb-/-中的表達量升高了(Fig. 2C),IFN-γ和IL-22沒有明顯變化(Fig. 2C)。上述結果表明TCRβ缺失引起了肝內異常的炎癥反應,從而影響了肝再生過程。

 Fig 2. 肝再生過程TCRβ缺失削弱炎癥激活反應

 

3. 體外實驗表明肝內免疫微環境調控肝細胞增殖

將小鼠永生花肝細胞系(NCTC1469)和從野生小鼠肝臟切除前后分離的肝內免疫細胞(或αβ T細胞)進行共培養,結果發現,肝臟再生前后αβ T細胞對肝細胞增殖活性沒有影響。相反,從肝切除Tcrb-/-小鼠分離的免疫細胞與小鼠正常肝細胞(NCTC1469)共培養后,肝細胞增值和Ki67表達明顯降低(Fig. 3A-D);而且肝細胞凋亡加劇(Fig. 3E, F)。Western blot結果進一步發現,細胞周期蛋白D1和p-STAT3的表達水平降低,caspase3的表達水平升高(Fig. 3G, H)。這些結果表明肝細胞增殖和凋亡是受肝內免疫微環境的調控,而不只是αβ T細胞的調控。

Fig 3. 肝內免疫微環境調控肝細胞增殖和凋亡(體外實驗)

 

4. TCRβ影響免疫細胞的激活

作者進一步研究TCRβ缺失是不是通過影響相關免疫亞群的富集和激活而影響肝再生。Tcrb-/-小鼠在肝再生過程中T細胞總數急劇減少,其中αβ T細胞的變化可忽略,但是γδ T細胞的數量顯著上升(Fig. 4A-C)。其他免疫細胞亞群(如NK/NKT和 Kupffer細胞)沒有顯著變化。那么,肝切除后免疫細胞亞群有何變化呢?γδ T細胞分泌的IL-17和IL-22在Tcrb-/-小鼠的表達量高于野生小鼠(Fig. 4D, E),活化的部分NK和NKT細胞(CD69+, NK1.1+)在Tcrb-/-小鼠的表達量高于野生小鼠(Fig. 4F, G),Kupffer細胞分泌的IL-6和TNF-α的表達量反而下降(Fig. 4H, I)。上述結果表明TCRβ缺失會選擇性激活NK、NKT和Kupffer細胞,減少穩定型NKT細胞,導致肝再生過程中γδ T細胞擴增,顯著削弱肝內免疫細胞的活化。

Fig 4. 肝再生過程TCRβ缺失引發異常的免疫微環境

 

5. 肝再生過程中Vβ和Jβ基因解析

肝內αβ T細胞在野生小鼠肝切除后急劇增加(Fig. 5 A, B),對肝切除前和切除6h后的肝內淋巴細胞進行TCRβ測序,共鑒定到23個不同的V基因和13個不同的J基因。頻率最高的V基因是TRBV13-2(肝切除前后分別是17.82%和20.76%)和TRBV1(肝切除前后分別是17.67%和20.43%),頻率最高的J基因是TRBJ2-7(肝切除前后分別是24.60%和22.79%)和TRBJ2-5(肝切除前后分別是14.52%和12.84%)(Fig. 5 C)。

Fig 5. 肝切除前、后(6h)V基因和J基因分布和豐度

V 基因和J基因的使用頻率在肝切除前后比較類似(Fig. 5 D, E),但是某些V基因在肝切除后發生了顯著變化,包括TRBV1、TRBV13-2、TRBV12-2、TRBV3和TRBV5(Fig. 5F)。V-J對在肝切除前后沒有顯著差異(Fig. 6A, B),只有16個V-J對(5.51%)在肝切除前后有顯著變化(Fig. 6C, D)。

Fig 6. 肝切除前、后(6h)V-J對的分布和豐度

6. 肝切除導致CDR3氨基酸多樣性偏低

CDR3氨基酸克隆型直接決定TCRβ的多樣性,本研究在肝切除前后共獲得418,944種CDR3氨基酸克隆型。長度為14個氨基酸的CDR3在肝切除后的使用頻率高于肝切除前(Fig. 7A)。雖然總的CDR3氨基酸克隆型在肝切除前后比較類似,但是肝切除后高頻CDR3氨基酸克隆型(閾值>0.008%, P<0.05)(Fig. 7B, C)和獨有的CDR3氨基酸克隆型比例明顯減少(Fig. 7D)。基尼系數、香農指數、Rank-abundance分析都表明肝切除后CDR3氨基酸多樣性降低(Fig. 7E-G)。上述結果表明肝切除后幾個關鍵的高頻CDR3氨基酸的使用頻率了發生變化,而且TCRβ免疫組庫多樣性降低。

Fig 7. 肝再生過程CDR3氨基酸克隆型分析

 

小結

基于高度異常的炎癥微環境和免疫微環境,在肝再生過程中,適應性免疫像是“指揮官”而不是“執行者”。同時,除了免疫狀態,不能排除還存在TCRβ調控肝再生的其他機制。因此,需要進一步研究其他可能的調控機制,以及TCRβ在肝再生過程如何和其他免疫細胞合作。

Fig 8. 肝再生過程αβ T細胞通過TCRβ重排調控免疫微環境

文章亮點

第一次展示肝再生過程中TCRβ免疫組庫的多樣化和弱化的免疫狀態,該結果至少部分說明TCRβ缺失導致肝再生發生缺陷。

 

參考文獻

Qing Liang, Zeyuan Liu, Chao Zhu, et al. Intrahepatic T cell receptor β immune repertoire is essential for liver regeneration. Hepatology. 2018. doi: 10.1002/hep.30067

- END -

Lisa  撰文

本文系歐易生物原創

轉載請注明本文轉自歐易生物

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