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膜體系酵母文庫

酵母雙雜交(Yeast two hybrid)技術是利用酵母遺傳學方法分析蛋白質之間的相互作用,被廣泛應用于蛋白質組學、細胞信號轉導和功能基因組學等領域,已成為分子生物學研究領域的重要實驗手段。經過不斷的完善和發展,不但可以檢測已知蛋白質之間的相互作用,更重要的在于還可發現與已知蛋白相互作用的未知蛋白。
傳統的酵母雙雜交系統僅限于核蛋白的互作分析,不能進行膜蛋白的研究。DUALmembrane 系統(DUALmembrane system)是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的膜蛋白酵母雙雜交系統,它提供了不同于常規酵母雙雜交系統的蛋白體內分析方法,使得分析膜蛋白間的互作成為現實。其主要特點是可以進行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白間的互作研究。它既可以用于表達文庫的篩選,也可以應用于兩個已知蛋白(其中一個屬于膜蛋白)間互作關系的驗證。

DUAL membrane系統

在酵母細胞中,泛素可分為兩部分表達,即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub),后者融合有能啟動核內報告基因表達的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在細胞中組成可分離的泛素蛋白([NubI:Cub]-reporter)體系。

DUAL membrane系統技術特點

任何一種膜蛋白都可以作為誘餌
在細胞膜上原位檢測蛋白-蛋白間的相互作用而無需核定位信號
使用分離的泛素結構域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白質之間的空間位阻最小化
蛋白間的互作信號依賴泛素特異性結合蛋白(UBPs)剪切人工轉錄因子(LexA)啟動,
而不是靠轉錄,因此可以檢測蛋白自身的轉錄激活或抑制序列

歐易特色

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提供內容

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文庫質粒100μg以上
Gateway體系可提供初級、次級文庫質粒及菌液

案例展示

膜體系——纖維素酶KORRIGAN纖維素合成酶復合體的成員


研究背景
植物生長和器官形成取決于負載的纖維素微纖絲在細胞壁中的定向沉積。纖維素是由大分子的纖維素合成酶復合物(CSC)合成的,它含有至少三種不同的纖維素合酶。植物和細菌中的纖維素合成也需要有活性的內酯-1,4-B-D-葡聚糖酶,但其在合成過程中的確切功能尚不清楚。
研究內容

KORRIGAN1 (KOR1)是定位在質膜上的內酯-1,4-B-D-葡聚糖酶。在其突變體中,植物一方面無法將CSC移動到細胞膜處;另一方面,纖維素合成酶抑制劑CGA3259615的活性也受到影響。結果表明KOR1對纖維素的合成具有重要作用。同時,作者還利用多種手段,發現KOR1是植物細胞壁CSC的組成部分。KOR1和CESA共定位在質膜和高爾基體,并通過膜體系酵母雙雜和BiFC證明了二者的相互作用。

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KOR1與CESA1,CESA3和CESA6相互作用


研究結果
1. 在野生型中,CESA3的質膜上的移動速度是253 nm min-1。而在kor1-1中,其移動速度下降為147 nm min-1。另外,CGA處理后,CESA3在質膜上的積累也受到抑制,突變體中這種異常積累更加顯著。結果表明KOR1對CSC的正常移
動和正確的定位具有重要功能。
2. 凝膠過濾實驗表明,在擬南芥中KOR1和CESA1定位在同一個大分子量復合物中。而在棉花中,KOR1定位在纖維發育相關的一個復合物中。
3. 構建35S驅動GFP-KOR1融合蛋白表達載體,說明GFP-KOR1定位在質膜上。進一步通過與FM4-64的共定位驗證這一結果。另外,亞細胞定位還證明,GFP-KOR1定位在高爾基體中。
4. GFP-KOR1在質膜上的移動速度為280 nm min-1,與GFP-CESA3 和GFP-CESA6的移動速度相似(分別為277 nm min-1和272 nm min-1)。另外,GFP-KOR1和GFP-CESA3的運動軌跡與微管重疊。以上結果說明GFP-KOR1與表皮細胞伸長
過程中微管的再定位有關。
5.表皮細胞中,GFP-KOR1與mCherry-CESA1在質膜上共定位。進一步用安磺靈處理,發現GFP-KOR1的移動并未受到影響,表明其移動不依賴于微管發生。
6.分裂泛素系統證明,KOR1能夠與CESA1、CESA3和CESA6相互作用。并經一步通過BiFC驗證了這一結果。

參考文獻

Vain T, Crowell EF, Timpano H, et al. The Cellulase KORRIGAN Is Part of the Cellulose Synthase Complex. Plant Physiol 2014; 165(4), 1521-1532. (IF: 6.841).


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